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Im Jahr 2009 mutiert ein zur Bekämpfung von Krebs entwickeltes onkolytisches Virus und tötet 90 der Weltbevölkerung. 0,2 aller Menschen (12 Millionen) sind immun. Die restlichen knapp 600 Millionen Überlebenden entwickeln zunächst Symptome, die der Tollwut gleichen, degenerieren aber bald in einen tierähnlichen Zustand, getrieben nur noch von Hunger und blinder Aggression gegen nicht Infizierte. Sie reagieren schmerzhaft auf UV-Licht und sind daher nur nach Sonnenuntergang aktiv.

Im Jahr 2012 ist der ehemals für das Militär arbeitende Virologe Dr. Robert Neville, der immun gegen das Virus ist, der letzte Überlebende dieser Seuche im allmählich von der Natur zurückeroberten New York City. Er verlor seine Familie bei einem Helikopterunfall während der Evakuierung Manhattans und hat seitdem nur noch die Schäferhündin Sam seiner Tochter als Gesellschaft. Im Kellerlabor seines Hauses arbeitet er an der Entwicklung eines Heilmittels, das er an infizierten Ratten und Menschen testet. Tagsüber sendet er immer wieder einen Radiofunkspruch, um andere Überlebende auf sich aufmerksam zu machen.

Als Hündin Sam eines Tages beim Jagen einem Hirsch in ein dunkles Gebäude folgt, rettet Robert sie und entdeckt dabei ein Nest mit Infizierten. Da er ein Exemplar für einen Menschenversuch benötigt, stellt er den Infizierten eine Falle, in die eine junge Frau gerät. Robert testet später im Labor ein im Tierversuch erfolgreiches Gegenmittel an ihr. Ein anderer Infizierter beobachtet Robert bei der Gefangennahme und setzt sich sogar kurze Zeit dem Sonnenlicht aus. Später gerät Robert in eine Falle der Erkrankten, die nach dem selben Prinzip aufgebaut ist. Er entkommt, aber Sam wird gebissen und vom Virus befallen.

Robert nimmt Sam mit nach Hause und spritzt ihr ein Gegenmittel. Nachdem er feststellt, dass sie bereits Symptome zeigt, erwürgt er die Hündin. Da er sich nun vollkommen alleine auf der Welt wähnt und ihn jeglicher Mut verlassen hat, fährt er nachts mit seinem Auto in eine Gruppe Infizierter, um möglichst viele davon in einem Racheakt zu töten. Seine Amokfahrt ist beinahe tödlich für ihn, nachdem sich Infizierte auf seinen Wagen werfen und ihn zum Umkippen bringen. Im letzten Moment kommt ihm Anna mit einem kleinen Jungen namens Ethan zu Hilfe und rettet ihn. Anna und Ethan sind ebenfalls immun und auf dem Weg nach Vermont, wo sich angeblich eine Kolonie Überlebender befindet.

Robert glaubt jedoch nicht an diese Kolonie, da bisher alle Rettungslager früher oder später überrannt wurden. Anna versucht ihn zu überreden, dennoch mit ihr nach Vermont aufzubrechen, da sie ihrer Meinung nach durch Gottes Plan seinen Funkspruch gehört habe, ihn deshalb gerade rechtzeitig retten konnte und sie daher nun bestimmt sind, dieses Lager zu finden. Robert hat aber den Glauben an Gott verloren und will bleiben.

In der folgenden Nacht wird Roberts Haus von Infizierten überrannt, die den Standort des Hauses herausgefunden hatten, indem sie Annas Wagen in der vorherigen Nacht gefolgt waren. Robert, Anna und Ethan flüchten in den Keller, wo Robert feststellt, dass eine der Proben seines Heilmittels bei der verseuchten Versuchsperson in seinem Labor Wirkung zeigt. Die Infizierten stürmen das Labor, und Robert, Anna und Ethan retten sich zunächst in einen Käfig aus massivem, doch nicht gegen Schlagwirkung sicheren Glas, in dem sich auch die inzwischen teilweise kurierte Versuchsperson befindet. Während die Erkrankten durch wiederholtes Rammen des Käfigs die Glasscheibe immer weiter zerstören, nimmt Robert der Geheilten Blut mit dem darin befindlichen Serum ab, übergibt den Vacutainer an Anna und Ethan und schickt sie damit in ein sicheres Versteck, den alten Kohlenschacht des Kellers. Robert opfert sich, indem er mit einer Granate sich selbst und die Angreifer tötet.

Anna und Ethan überleben die Explosion in ihrem Versteck und machen sich auf den Weg nach Vermont, wo sie eine festungsartige Kolonie Überlebender finden. Dort übergibt Anna den Vacutainer mit dem Heilmittel und erklärt das Überleben der Menschheit zu Roberts Vermächtnis.

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